Die ab 1517 öffentlich erhobenen Forderungen des Theologieprofessors Martin Luthers nach einer grundlegenden Reform der Kirche fanden auch in Bayern Anhänger. Doch sorgte eine entschiedene Religionspolitik der Herzöge dafür, dass das gesamte Gebiet des Bistums Freising im Zeitalter der Glaubensspaltung katholisch blieb. Ihr Kampf gegen die Reformation war jedoch stets verbunden mit dem Bemühen um die herrschaftliche Einheit Bayerns und eine Erneuerung der katholischen Kirche.
Infolge des Dreißigjährigen Kriegs kamen die Reformanstöße des Konzils von Trient (1545-1563) erst im Lauf des 17. Jahrhunderts breiter zum Tragen. Dann aber führten die Neuordnung von Priesterausbildung und Liturgie, das Wirken alter und neuer Orden sowie die Förderung von Wallfahrten und Bruderschaften zu einer neuen Blüte des kirchlichen Lebens.
In Freising beging Fürstbischof Johann Franz Eckher von Kapfing und Liechteneck – zugleich Seelsorgebischof und Freund von Geschichte und Kunst – 1724 mit großem Aufwand die Jahrtausend-Feier der Ankunft des hl. Korbinian und ließ dazu auch den Dom neu ausstatten. Die Barockzeit prägte durch Umgestaltung und Neubau zahlreicher Kirchen die bayerische Kirchenlandschaft bis heute.
Die Französische Revolution und die Kriegszüge Napoleons führten 1802/03 zum Ende der Reichskirche und damit auch zu dem des Fürstbistums Freising. Nach dem Tod des letzten Fürstbischofs Joseph Konrad von Schroffenberg 1803 blieb die Diözese 18 Jahre ohne Oberhirten und musste provisorisch verwaltet werden. Die Säkularisation aller Klöster bedeutete einen tiefen Einschnitt in das religiöse und kulturelle Leben des ganzen Landes.